Sylvie Testud naît le {{date}} à Lyon, élevée par une mère comptable. Ses parents se séparent lorsqu'elle a deux ans. Elle passe son enfance et son adolescence dans le quartier lyonnais de la Croix-Rousse.
Elle décide de devenir actrice au cours de sa jeunesse. Sylvie voyait les actrices, qu'elle admirait tant dans les films, en pensant que leur vie était meilleure que la sienne mais, au fil du temps, elle a trouvé d'autres motivations. Elle prend alors des cours de théâtre à Lyon avec le comédien et metteur en scène Christian Taponard. En 1989, elle s'installe à Paris pour suivre des études d'histoire, ainsi que des cours d'art dramatique aux classes libres du Cours Florent, puis au Conservatoire national supérieur d'art dramatique pendant trois ans, avec Jacques Lassalle et Catherine Hiegel pour professeurs.
Au début des années 1990, elle obtient ses premiers petits rôles au cinéma, puis des longs métrages comme L'Histoire du garçon qui voulait qu'on l'embrasse de Philippe Harel (1994), Le Plus Bel Âge..., de Didier Haudepin (1995) ou encore Love, etc. de Marion Vernoux (1996).
En 1997, Sylvie Testud connaît un premier grand succès au cinéma en Allemagne avec le film Au-delà du silence de Caroline Link, pour lequel elle apprend la langue allemande, la clarinette et la langue des signes. Elle est récompensée comme meilleure actrice aux Prix du film allemand (l'équivalent allemand du César de la meilleure actrice). En 1998, elle joue son premier grand rôle au cinéma français et connaît son premier grand succès en France avec le rôle de Béa dans Karnaval, le premier long-métrage de Thomas Vincent, pour lequel elle est nommée au César du meilleur espoir féminin et reçoit le Prix Michel Simon. Elle commence alors une importante carrière d'actrice avec une préférence pour le cinéma d'auteur.
En 2000, sa prestation dans La Captive de Chantal Akerman (adaptation du roman La Prisonnière de Marcel Proust) lui vaut une nomination au prix de la meilleure actrice du Prix du cinéma européen. En 2001, elle obtient, pour sa deuxième nomination, le César du meilleur espoir féminin pour une interprétation biographique remarquée de Christine Papin, une des sœurs Papin, dans Les Blessures assassines de Jean-Pierre Denis, une histoire d'une jeune domestique qui souffre de psychose paranoïaque et qui avait défrayé la chronique en 1933 dans une affaire de meurtre de son employeuse avec la complicité de sa sœur Léa.
En 2003, Sylvie Testud inaugure une carrière parallèle de romancière en publiant une biographie de sa vie d'actrice sous le titre Il n'y a pas beaucoup d'étoiles ce soir, aux éditions Pauvert.
En 2004, elle obtient un second César, cette fois celui de la meilleure actrice, ainsi que le Prix Lumière de la meilleure actrice et l'Étoile d'or du cinéma français pour le meilleur premier rôle féminin grâce à son interprétation dans le film Stupeur et Tremblements d'Alain Corneau, une adaptation du roman homonyme de la romancière Amélie Nothomb, où elle joue le rôle de cette dernière en proie aux difficultés et à la différence de culture entre le monde professionnel japonais et le monde occidental belge dont elle est originaire. Pour ce rôle, elle a dû apprendre ses répliques en japonais grâce à une méthode phonétique.
Sylvie Testud a deux enfants, Ruben (né le {{date}}) et Esther (née le {{date}}).
En 2012 elle a participé à Rendez-vous en terre inconnue, diffusée le 2 octobre 2012 sur France 2. Elle s'est rendue avec Frédéric Lopez chez les Goranes, au Tchad.