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Né à Fontainebleau de parents libraires, après un CAP de dessin industriel et un reclassement en terminale A4 et une année d'armée en Allemagne, il entre dans une école de graphisme publicitaire. Il rencontre Jean-Christophe Menu dans un colloque de Cerisy en 1987, ce qui lui permet de comprendre qu'il est possible de faire de la bande dessinée sans connaître le dessin académique.
Harry Morgan, auteur du fanzine The Adamantine, décide Trondheim à lancer son propre fanzine, Approximate Continuum Comics Institute H3319 (ACCI H3319). Les Cahiers de la bande dessinée y voient dès novembre 1988 « la naissance d'un nouvel humoriste ». Il produit « douze numéros et demi ». Certaines des histoires comportaient des visages humains, ce qu'il abandonne définitivement par la suite. Le premier livre de Trondheim, Psychanalyse, est un recueil d'histoires courtes publiées dans ACCI H3319.
En 1990, il fonde L'Association, en collaboration avec Jean-Christophe Menu, David B., Stanislas, Mattt Konture, Patrice Killoffer et Mokeït. Dans le cadre des expérimentations de cette nouvelle maison d'édition, Trondheim se lance dans un exercice de style bien déterminé : créer une bande dessinée de 500 pages exactement, sans crayonné, sans scénario écrit au préalable et en respectant un format "gaufrier" de trois cases sur quatre. Contrainte supplémentaire : avant d'entamer cet exercice, il ne sait pas dessiner (c'est du moins ce qu'il prétend). C'est ainsi que naît Lapinot et les carottes de Patagonie, que certains qualifieront d'« ouvrage clé de l’œuvre de Trondheim », d'« album monumental, surprenant, inédit, indémodable et fondateur de ce que l’on nommera un peu pompeusement la “nouvelle bande dessinée” ».
En 1992, il s'installe à l'Atelier Nawak avec Jean-Christophe Menu, Jean-Pierre Duffour, Emile Bravo, Christophe Blain, David B., suivi de Joann Sfar, et Fabrice Tarrin.
Début 1993, il participe à la création de l'OuBaPo (Ouvroir de Bande-dessinée Potentielle), dont il fera partie pendant plusieurs années. Trondheim en est un des précurseurs, avec la bande dessinée Moins d'un quart de seconde pour vivre, créée avec Jean-Christophe Menu au dessin en 1991, donc avant le lancement officiel de l'OuBaPo{{,}}.
En 2000, il réalise une série d'animation, Les Aventures d'une mouche, inspirée de sa bande dessinée La Mouche, avec l'aide de Samuel Kaminka et d'un coproducteur canadien. Les 65 épisodes sont notamment diffusés sur la chaîne de télévision française France 3 dans MNK, TO3 et France Truc et sur Télétoon.
En 2004, Lewis Trondheim a annoncé à la surprise générale qu'il comptait cesser d'être un auteur de bandes-dessinées et ne se consacrerait plus qu'à la version animée du Roi Catastrophe{{refnec}}. Il se consacre depuis à cette dernière et à Donjon. Mais la version animée est finalement annulée et il a depuis écrit et dessiné bien d'autres albums.
En 2005, il lance sa collection Shampooing, chez Delcourt. Cette année-là naît une rumeur persistante (malgré plusieurs démentis), dont une vidéo du Frantico sur son blog, qui veut aussi qu'il soit l'auteur énigmatique de la BD blog à succès Frantico. Il crée également son propre blog BD, Les Petits Riens. Fin 2006, il annonce son départ de L'Association en raison de « divergences éditoriales » avec Jean-Christophe Menu{{,}}.
En 2007, il participe à la fondation du « Syndicat des Auteurs de Bande Dessinée » (SNAC-BD). Il crée la mascotte et trophée du Festival d'Angoulême, Le Fauve.
En 2013, il fonde avec Yannick Lejeune la revue de bande dessinée Papier publiée par Delcourt dans la collection Shampooing.
En 2015, il co-scénariste avec Davy Mourier une série télévisée nommée {{lang}} diffusée par France 4;
Il joue, comme Joann Sfar, du ukulélé. Il accompagne de cet instrument Judith Holofernes, la chanteuse et guitariste allemande du groupe Wir sind Helden qui lui a demandé de faire des illustrations pour ses concerts.
Membre du Réseau éducation sans frontières, Trondheim est le parrain d'un jeune marocain, Abderrahmane. Début 2011, il participe à une campagne afin de s'opposer à son expulsion.
Il est marié à la coloriste Brigitte Findakly.