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Né à New York, Joseph Hill Whedon est le fils de Tom Whedon, scénariste de séries télévisées dans les années 1970 et 1980, et de Lee Stearns, professeure d'histoire. Son grand-père est John Whedon qui était scénariste pour des sitcoms telles que The Donna Reed Show et {{lang}} dans les années 1950. Il a deux frères aînés, Samuel et Matthew, et deux frères cadets, Jed et Zack. Ses parents divorcent quand il a neuf ans et il vit alors avec son père mais passe les étés avec sa mère. Au collège, il passe deux ans en Angleterre, au Winchester College, avant de revenir aux États-Unis. Il fait ses études supérieures à l'université Wesleyenne et en sort diplômé en 1987. À l'université, il est fortement influencé par Jeanine Basinger, sa professeure d'études cinématographiques.
Whedon part pour Los Angeles et commence à travailler sur la série Roseanne, puis sur la série {{lang}}. Enfin, en 1992, Joss Whedon est au générique du film Buffy, tueuse de vampires, comme scénariste. Mais ce film ne correspond pas à la vision de Whedon. La réalisatrice Fran Rubel Kuzui remanie son scénario pour le rendre plus léger, plus proche d'une comédie adolescente, alors qu'il l'avait écrit de façon à mettre en avant le côté horrifique et les émotions. Il est également très déçu par l'attitude de Donald Sutherland sur le tournage. Le film est un échec à la fois critique et commercial. Il travaille alors comme script doctor, réécrivant de façon non créditée des dialogues de Guet-Apens (1994), {{lang}} (1994), Mort ou vif (1995), {{lang}} (1995) et {{lang}} (1996), un travail très lucratif mais qui ne le satisfait pas. Il apprécie néanmoins son travail sur {{lang}}, film pour lequel il écrit quasiment tous les dialogues.
En 1995, il est coscénariste, avec six autres personnes, du film d'animation {{lang}}, pour lequel il est nommé pour l'Oscar du meilleur scénario original. En 1997, il écrit le scénario dAlien, la résurrection, considérant ce travail comme une bénédiction car il est un grand admirateur des deux premiers films de la saga Alien. Mais il considère la réalisation de Jean-Pierre Jeunet comme une trahison et cette nouvelle déception le pousse à travailler sur un projet sur lequel il pourra avoir un contrôle créatif total, la série Buffy contre les vampires.
En 1998, Whedon écrit la chanson {{lang}} (Mon chant d'espoir) pour le dessin animé Le Roi lion 2. Par la suite, il participe à l'écriture des scénarios de Titan A.E. (2000), X-Men (2000) et Atlantide, l'empire perdu (2001) mais très peu de son travail sur ces trois films est finalement conservé (notamment pour X-Men où seulement deux lignes de dialogues qu'il a écrites sont conservées). Longtemps associé au projet cinématographique d'adaptation des aventures de {{lang}}, Whedon, qui devait produire et diriger le film l'abandonne finalement du fait de désaccords artistiques avec la société Warner Bros, les deux parties n'ayant pas su s'entendre sur un scénario.
N'ayant jamais abandonné l'idée de Buffy, Whedon prépare une version télévisée. Au lieu de reprendre l'histoire racontée dans le film, Whedon décide que la série commence quand le film finit : Buffy quitte Los Angeles après que son école a pris feu et vient s'installer dans la ville de Sunnydale en Californie. Un pilote est tourné, avec l'actrice Riff Regan dans le rôle de Willow Rosenberg. Lorsque le pilote est tourné à nouveau, Alyson Hannigan obtient le rôle. En 1997, pour combler un trou dans la grille des programmes du réseau télévisé américain The WB, Buffy contre les vampires est programmé pour une demi-saison de 12 épisodes. Le succès est immédiat et la série peut continuer. Elle est diffusée pendant cinq ans sur The WB, puis pour deux années supplémentaires sur UPN.
Buffy contre les vampires a acquis le statut de série-culte et a influencé d'autres séries telles que {{lang}}, Alias, {{lang}} et Supernatural. Elle est abondamment étudiée de façon académique pour ses thèmes influents et son impact sur la culture populaire et sa popularité perdure encore plusieurs années après son arrêt.
En 1999, Whedon et David Greenwalt font sortir le personnage d'Angel de la série Buffy contre les vampires et lui consacrent une série dérivée qui dure cinq saisons, également sur The WB. Plusieurs fois, Angel revient dans la série Buffy contre les vampires pour quelques épisodes, de même que certains personnages de Buffy se retrouvent dans la série Angel. Vu au départ comme un spin-off maladroit de Buffy contre les vampires, Angel a trouvé sa propre voie vers la reconnaissance à travers son ton plus sombre et plus adulte.
En 2002, Whedon crée {{lang}}, une série de science-fiction inspirée par l'époque de la guerre de Sécession, dont il compose le générique. La chaîne de télévision américaine FOX ne diffuse pas la série dans l'ordre prévu et l'arrête au bout de douze épisodes. À ces douze épisodes s'ajoutent trois épisodes supplémentaires non-diffusés pour un total de quinze épisodes. Malgré l'arrêt prématuré de la série, {{lang}} est désormais considérée comme une série culte.
Les bonnes ventes de coffrets DVD de la série contribuent à financer le film {{lang}}, écrit et réalisé par Whedon, qui reprend l'intrigue de {{lang}}. {{lang}} est un échec commercial mais reçoit de bonnes critiques et remporte le prix Hugo du meilleur long-métrage et le prix Nebula du meilleur scénario en 2006.
En 2008, Whedon écrit et réalise {{lang}}, une web-série de trois mini-épisodes (pour une durée totale de 42 minutes) qui met en scène, sous forme de comédie musicale la rivalité « professionnelle » et amoureuse entre un super-vilain, le {{Dr}} {{lang}}, et un super-héros, {{lang}}. Whedon démontre avec cette série, réalisée pendant la grève de la Writers Guild of America, qu'un projet de qualité peut être produit avec peu de moyens, en utilisant Internet et en contournant ainsi le système des grands studios de télévision et de cinéma. Cette série est disponible gratuitement sur Internet.
En 2009, {{lang}}, la nouvelle série de Whedon avec Eliza Dushku dans le rôle principal, est programmée sur la Fox. Dans {{lang}}, des hommes et des femmes sont programmés pour remplir des missions secrètes spécifiques et on leur programme à chaque fois une nouvelle personnalité, des capacités et des mémoires différentes. Après chaque mission, leurs souvenirs sont effacés et ils retournent au laboratoire secret nommé {{lang}} (« maison de poupées »). Dans cet étrange univers, Echo, une jeune « poupée », voit ses souvenirs refaire peu à peu surface. Cette série dure deux saisons avant d'être annulée pour manque d'audience, Whedon regrettant après coup n'avoir pas pu explorer comme il le souhaitait le thème de la sexualité en raison de la frilosité des dirigeants de la Fox à ce sujet.
Whedon écrit ensuite avec son ami Drew Goddard le scénario de La Cabane dans les bois, ayant dans l'idée de revitaliser le genre slasher tout en réalisant une satire du cinéma gore. Whedon produit le film et Goddard le réalise. Bien que tourné en 2009, il ne sort au cinéma qu'en 2012 en raison des déboires rencontrés par son distributeur initial et est très bien accueilli par la critique.
Depuis le rachat de Marvel Entertainment par The Walt Disney Company, la politique de gestion des adaptations cinématographiques a quelque peu évolué ; après L'Incroyable Hulk, Iron Man 2, Thor et {{lang}} en trois ans, le concept {{lang}} conçu en avril 2005 par le président de Marvel Studios Avi Arad, vient à terme avec le film {{lang}} tourné à partir du {{Date}} et qui est sorti le mercredi {{Date}}. Whedon se voit offrir un tournant dans sa carrière en réalisant {{lang}}, l'un des plus gros blockbusters américains de l'année 2012. {{lang}} est, à sa sortie, le troisième plus grand succès commercial de l'histoire du cinéma et a obtenu de très bonnes critiques, bien que Whedon lui-même le considère comme imparfait et {{Citation}}.
Après cette super-production, Whedon revient dans l'univers du film indépendant avec Beaucoup de bruit pour rien, adaptation moderne de la pièce du même nom de William Shakespeare. Whedon tourne ce film en noir et blanc en deux semaines dans sa résidence de Santa Monica, profitant des vacances lui étant octroyées entre le tournage et le montage d’{{lang}} et s'entourant d'acteurs qui lui sont proches.
Whedon reste toutefois dans l'univers Marvel en signant un contrat avec Marvel Studios par lequel il est engagé pour créer la série télévisée {{lang}}, dont la première saison est diffusée à partir de septembre 2013, et pour écrire et réaliser le film {{lang}}, sorti en avril 2015. Whedon se déclare satisfait de son deuxième long-métrage Marvel mais sort toutefois exténué de sa production, affirmant que c'est {{Citation}}. Il estime très peu probable qu'il continue à se consacrer à l'univers Marvel, préférant se tourner à l'avenir vers des projets plus personnels. Avengers : L'Ère d'Ultron connaît un succès commercial presque comparable à celui d{{lang}} et obtient des critiques globalement favorables mais néanmoins moins flatteuses que le premier volet
Whedon a scénarisé la mini-série Fray (2001), chez {{lang}}, une extension de la série Buffy contre les vampires mettant en scène la Tueuse de vampires d'un futur où les créatures de la nuit sont censées avoir disparu.
Il scénarise de 2004 à 2007 {{lang}} chez Marvel Comics, la série dessinée par John Cassaday.
Whedon a supervisé la huitième saison de Buffy. Éditée chez {{lang}} aux États-Unis de 2007 à 2011 et chez Fusion Comics en France, cette bande dessinée reprend la suite de la série télévisée arrêtée depuis juin 2003. Une saison est composée de 40 numéros. En France, une bande dessinée réunit six numéros. La neuvième saison a été publiée de septembre 2011 à août 2013 aux États-Unis et est la suite directe de la saison précédente. La publication de la dixième saison a commencé en mars 2014.
Whedon a également travaillé sur une suite en comics de la série télévisée Angel, nommée {{lang}}, éditée par IDW aux États-Unis de 2007 à 2011. En même temps que les comics de Buffy, Whedon publie depuis 2011 Angel & Faith, un nouveau comic dont l'histoire est axée sur la collaboration du vampire et de la Tueuse de vampires Faith après les évènements de Buffy Saison huit.