Il ouvre une agence immobilière en 1983, avant de se tourner vers le théâtre. Il écrit un one-man-show avec Les Femmes et les Enfants à mort, qu'il joue au festival d'Avignon. Il quitte alors son métier d'agent immobilier pour se lancer définitivement dans le spectacle.
Patrick Timsit se fait remarquer au début des années 1990 par son ton corrosif dans ses sketchs et dans ses passages télés (souvent chez Christophe Dechavanne), n'hésitant pas à égratigner certaines personnalités populaires et à pratiquer l'humour noir. Il aborde également des sujets délicats, comme la politique, le racisme, l'antisémitisme, le conflit israélo-palestinien, la santé, (le monde médical et la recherche), la défense des droits des homosexuels, sur un mode provocateur. Un sketch dans lequel son personnage tient des propos jugés insultants pour les handicapés mentaux lui vaudra un procès.
En 1991, il débute au cinéma, avec Une époque formidable de Gérard Jugnot, suivi de La Crise de Coline Serreau en 1992.
Un Indien dans la ville, en 1994, est un immense succès populaire. Patrick Timsit enchaîne dès lors les succès avec des rôles principaux dans Pédale douce, Quasimodo d'El Paris (sa première réalisation), L'Art (délicat) de la séduction et des rôles secondaires dans Les Clefs de bagnole, Les Onze Commandements ou Incontrôlable. Il s'essaye également au film policier dans Le Cousin, réalisé par Alain Corneau.
Hormis Quasimodo d'El Paris, ses films en tant que réalisateur sont assez mal reçus, et ne connaissent pas un grand succès public. Il a d'ailleurs reconnu avoir mal vécu l'échec de son film L'Américain.
En 2005, il incarne sur scène le personnage de François Pignon, créé par Jacques Brel, dans l'adaptation théâtrale de L'Emmerdeur de Francis Veber, avec Richard Berry. Si la pièce est un succès, le film tourné par les mêmes en 2008 est un échec commercial, tout comme l'adaptation en comédie musicale des Aventures de Rabbi Jacob, qu'il met en scène au Palais des congrès de Paris la même année, mal reçue par la critique et boudée par les spectateurs.
En revanche, son retour sur scène avec son One Man Stand-up Show (sous-titré « Le spectacle de l'homme seul debout »), coécrit, comme les précédents, avec les anciens auteurs des Guignols de l'info Bruno Gaccio et Jean-François Halin, est un vrai succès{{Référence souhaitée}}.