À 13 ans, il prend des cours de clown et pantomime, fasciné par Marcel Marceau. Formé au conservatoire, il commence sa carrière au théâtre, avec Hamlet et Le marchand de Venise de Shakespeare, avant d'être révélé au cinéma par le cinéaste Léos Carax, qui lui confie le rôle masculin emblématique d'Alex dans Boy Meets Girl, puis dans Mauvais Sang aux côtés de Juliette Binoche.
Durant le tournage du troisième long-métrage de Carax, Les Amants du Pont-Neuf, où il incarne encore Alex, Denis Lavant se blesse au pied, ce qui contribue à l'arrêt momentané du tournage et au dépassement de budget du film. Sa carrière, par la suite, se déroule essentiellement au théâtre. On le retrouve cependant dans un certain nombre de rôles cinématographiques : il tient notamment des rôles principaux dans La Partie d'échecs (1991), Visiblement je vous aime (1995), Beau Travail de Claire Denis (1999) et Capitaine Achab (2007). Il tient également un rôle secondaire dans Un long dimanche de fiançailles, de Jean-Pierre Jeunet.
Il retrouve ensuite à nouveau Leos Carax, en 2008 pour une partie du film Tokyo!, et, en 2012, pour Holy Motors. Ce film lui vaut une nomination au César 2013 du Meilleur Acteur.
En 2012, Denis Lavant obtient le Prix de l'Humour noir du spectacle pour son adaptation théâtrale de La grande vie de Jean-Pierre Martinet.
Il est le parrain de la quinzième édition du Printemps des Poètes (mars 2013).
À partir de septembre 2013, il est aux côtés de la chanteuse Sapho, du rappeur Disiz et du musicien Mehdi Haddab dans la pièce de théâtre Les Amours Vulnérables de Desdémone et Othello, de Manuel Piolat Soleymat & Razerka Ben Sadia-Lavant, mis en scène par Razerka Ben Sadia-Lavant, au Théâtre Nanterre-Amandiers. En octobre 2013, il part en tournée avec la Compagnie du hanneton, dans le spectacle Tabac Rouge, un "chorédrame" de James Thierrée. En 2014 Denis Lavant est en tournée avec le rôle de Pyrrhus (Néoptolème, fils d'Achille) dans la pièce Andromaque.10-43.