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Marie Gillain passe son enfance en Belgique au hameau de Fêchereux près du village de Neufchâteau faisant partie de la commune de Dalhem dans le Pays de Herve. Elle fait ses études au collège Saint-Louis de Liège.
Très jeune, elle se passionne pour l’univers du spectacle et participe durant son adolescence à un atelier d’expression théâtrale. C’est en 1989 qu’elle tente de saisir sa chance dans le monde du cinéma. Alors âgée de 14 ans, elle passe des essais pour L'Amant, de Jean-Jacques Annaud, mais n'est finalement pas retenue.
Il faut attendre un an avant sa révélation dans Mon père, ce héros, film où elle joue au côté de Gérard Depardieu et qui lui vaut sa première nomination aux César. Elle joue en Belgique, sa terre natale, pour son deuxième film Marie en 1993. Cette année est marquée par sa rencontre avec Bertrand Tavernier qui lui propose de tourner dans son prochain film L'Appât. Ce rôle, qui lui vaut une nouvelle nomination aux César, un ours d'or à Berlin et le Prix Romy-Schneider, marque un tournant dans sa carrière cinématographique. Dans les années qui suivent, elle multiplie les rôles dans des registres aussi variés que la comédie, le drame, l’aventure ou le policier.
Marie Gillain au festival de Cannes 2006.
Entre 1996 et 2009, elle est dirigée par Philippe de Broca dans Le bossu, les frères Taviani dans Les Affinités électives, Ettore Scola dans La cena, Régis Wargnier dans Pars vite et reviens tard, Cédric Klapisch dans Ni pour ni contre (bien au contraire), Guillaume Nicloux dans La clef, Danis Tanović dans L'Enfer, Anne Fontaine dans Coco Chanel entre autres.
En 2011, elle incarne Claire, l'héroïne du film de Philippe Lioret Toutes nos envies aux côtés de Vincent Lindon, ce qui lui vaut une nouvelle nomination pour le César de la meilleure actrice. Elle enchaîne avec le premier film de François-Xavier Vives Landes avec pour partenaires Jalil Lespert et Miou-Miou.
En décembre 2011 elle est membre du jury des courts métrages lors du Festival de Marrakech, présidée par Sigourney Weaver.
Au théâtre, elle incarne Anne Frank et est dirigée par John Malkovitch dans Hystéria de Terry Johnson.
En 2014 elle est membre du jury du {{6e}} Festival international du film policier de Beaune.
Le 27 avril 2015, elle obtient le Molière de la comédienne pour La Vénus à la fourrure de David Ives. En août 2015 elle est membre du jury du Festival du film francophone d'Angoulême présidé par Jean-Hugues Anglade. Le mois suivant elle fait partie du jury de Benoît Jacquot lors du {{41e}} Festival du cinéma américain de Deauville.
Marie Gillain a deux enfants, Dune née en 2004 d'une union avec le musicien Martin Gamet, et Vega née en 2009 de son union avec l'acteur franco-italien Christophe d'Esposti.