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Fils d’un père français et d’une mère issue de l’aristocratie russo-géorgienne à la personnalité extravagante, Guillaume Gallienne est le troisième garçon d'une fratrie de quatre enfants ; il passe sa jeunesse dans le 16{{e}} arrondissement de Paris. Durant son enfance et son adolescence, il est complexé par sa faiblesse physique. Sa mère le distinguant de ses frères, il en arrive à considérer ne pas être un garçon comme eux, et adopte des attitudes féminines. Lui-même explique, par la suite : {{citation}}. Cela le conduit, à l'âge de douze ans, à tomber en dépression. Il parvient à en sortir en « trouvant sa voix » grâce à un phoniatre et en consultant un psychanalyste. Cet aspect de sa biographie fournit plus tard la matière de son one-man-show Les Garçons et Guillaume, à table !, qu'il adapte ensuite au cinéma.
Guillaume Gallienne suit d'abord une scolarité en hypokhâgne au lycée Jean-Pierre Vernant à Sèvres puis obtient une maîtrise d'histoire. Il découvre sa vocation de comédien à l'âge de 18 ans, à la suite du décès d'une cousine à laquelle il était très attaché : {{citation}}. Il est élève au Cours Florent pendant quatre ans (cycle de formation et Classe libre) ; il étudie ensuite au Conservatoire national supérieur d'art dramatique dans les classes de Dominique Valadié, Stéphane Braunschweig et Daniel Mesguich.
Dans les années 1990, il apparait dans des publicités télévisées telles que celles du label Promotelec ou de la Volkswagen Golf.
Au cinéma, le grand public le découvre en 2000 grâce à son rôle dans Jet Set. En 2001, il fait la connaissance d'Amandine, styliste, qu'il épouse en 2005, surprenant ses parents qui le croyaient homosexuel : {{citation}}.
À la radio, le comédien prête sa voix à la lecture de grands textes de la littérature (Les Fleurs du mal de Baudelaire, Sodome et Gomorrhe de Marcel Proust...), sur France Inter notamment.
Dans un autre domaine, il s'associe en 2005 au danseur étoile Nicolas Le Riche pour écrire le livret de son ballet Caligula, donné par le ballet de l'Opéra de Paris, et six ans plus tard, il aide le chorégraphe russe Alexeï Ratmansky à adapter Illusions perdues (Honoré de Balzac) pour le ballet du Bolchoï.
En 2006, il met en scène Huis clos, de Jean-Paul Sartre, au théâtre Noh Tessenkai a Tokyo. La distribution réunit Nicolas Le Riche, Thierry de Peretti, Anne Bouvier et Martine Chevallier, de la Comédie-Française.
Parallèlement, il multiplie les apparitions au cinéma, toujours dans des rôles secondaires : il est souvent recruté pour jouer les bourgeois un peu ridicules : en 2003, dans le film de cape d'épée Fanfan la tulipe ; en 2005 dans Tu vas rire, mais je te quitte, de Philippe Harel ; en 2006, dans La Jungle de Mathieu Delaporte, puis Mon colonel de Laurent Herbiet, ou encore le Marie-Antoinette, de l'américaine Sofia Coppola.
II accède aussi à des rôles plus différents : en 2003 par François Dupeyron pour Monsieur Ibrahim et les Fleurs du Coran ; en 2007, la comédie dramatique Le Candidat, écrite et réalisée par Niels Arestrup ; et en 2008, il enchaîne le biopic Sagan, de Diane Kurys et Musée haut, musée bas de Jean-Michel Ribes.
Mais c'est sur les planches qu'il parvient à jouer un rôle d'envergure : en 2008, il se lance avec Claude Mathieu dans l'écriture d'un spectacle intime intitulé Les garçons et Guillaume, à table !, dans lequel il revient avec humour sur son enfance, l'éducation qu'il a reçue et les traumatismes qu'elle a pu engendrer.
Guillaume Gallienne au festival de Cannes 2009. De septembre 2008 à 2010, il anime dans l'émission Le Grand Journal sur Canal+ un module intitulé Les Bonus de Guillaume, dans lequel il imagine le bonus DVD d'un film à l'affiche.
Depuis septembre 2009, il anime chaque samedi l’émission Ça peut pas faire de mal sur France Inter, dans laquelle il lit des extraits d’œuvres littéraires.
Cette exposition lui permet de décrocher des rôles de plus en plus importants : en 2010, il côtoie le couple incarné par Marina Hands et Julien Doré dans la romance Ensemble, nous allons vivre une très, très grande histoire d'amour..., écrite et réalisée par Pascal Thomas ; puis fait partie de la distribution réunie par Olivier Baroux autour de Kad Merad dans la comédie L'Italien. Mais c'est surtout la grosse production Astérix et Obélix : Au service de Sa Majesté, de Laurent Tirard, qui lui permet de s'imposer, avec le rôle de Jolitorax.
En 2012, il participe à l'album de Juliette Gréco Ça se traverse et c'est beau, en lisant le texte Le Pont Juliette ; et chante dans l'album Le Bœuf sur le toit du pianiste français Alexandre Tharaud.
En 2013, il participe en tant que lecteur à l’émission de France Culture Le Gai Savoir en lisant des extraits de Marcel Proust. La même année, sort son premier long métrage.
Guillaume Gallienne en 2012 à l'avant-première de Astérix et Obélix : Au service de sa Majesté. Les Garçons et Guillaume, à table ! est une adaptation de son spectacle de 2008, où il incarnait déjà sa mère. Le film égale le record de nominations aux César du cinéma en étant présent dans 10 catégories.
Alors que l'attention des médias se porte sur ce film, Guillaume Gallienne y est revenu, dans l'émission Sept à Huit, pour y confier les similitudes avec sa propre jeunesse : il indique par exemple qu'il « a été obligé d'admettre très tôt qu'il ne pourrait jamais correspondre aux critères de masculinité qu'il y avait dans sa famille », et qu'il a été confronté à l'homophobie dès l'âge de 10 ans. Lui-même précise être bisexuel : {{citation}}.
En 2014, Les Garçons et Guillaume, à table !, remporte cinq Césars : meilleur film, meilleur acteur, meilleur premier film, meilleur montage et meilleure adaptation.
Désormais acteur reconnu, il se voit confier des rôles complexes et convoités : en 2014, il prête ses traits à Pierre Bergé dans le biopic Yves Saint Laurent, de Jalil Lespert, qui connaît un joli succès à l'international ; puis en 2016, à Paul Cézanne, dans Cézanne et moi, de Danièle Thompson, qui l'avait dirigé dix ans plus tôt dans Fauteuils d'orchestre.
Guillaume Gallienne est le père d'un enfant, né en 2007. Lui et son épouse sont russes orthodoxes.
À l'occasion des élections européennes de mai 2014, il s'affirme en européen convaincu dans une vidéo réalisée par Européens sans frontières où il incite les Français à aller voter.