Née d'un père cadre commercial dans la grande distribution natif de Lyon et d'une mère au foyer originaire de Lille, Anaïs Demoustier grandit à Villeneuve-d’Ascq avec ses sœurs Camille et Jeanne, et son frère Stéphane qui lui fait découvrir et aimer le cinéma.
Encore adolescente, elle passe des auditions et débute aux côtés d'Isabelle Huppert dans Le Temps du loup (2002) de Michael Haneke.
À partir de la première, elle suit la section cinéma-audiovisuel au lycée Sainte Thérèse-d'Avila de Lille.
Après son bac en 2005, elle vient à Paris pour faire une licence de lettres et cinéma à l'Université Paris III-Censier. Cependant, elle lâche assez vite la fac pour enchaîner des rôles secondaires au cinéma et au théâtre.
Peu à peu, on lui attribue des rôles plus importants, ainsi dans La Belle Personne (2008) de Christophe Honoré où elle côtoie de jeunes acteurs français pleins de promesses (Léa Seydoux, Grégoire Leprince-Ringuet, Louis Garrel...).
Elle est nommée deux fois aux Césars (en 2009 et 2011), une fois aux Molières (2011) et décroche plusieurs récompenses, dont le prix Romy-Schneider en 2011.
Des réalisateurs renommés (Claude Miller, Pascale Ferran, Bertrand Tavernier) lui confient des rôles qui lui permettent de s'épanouir davantage. En 2013, elle retravaille avec Robert Guédiguian et des acteurs (Ariane Ascaride, Jean-Pierre Darroussin) qu'elle a déjà côtoyés plusieurs fois.
En 2014, elle est à l'affiche du nouveau film de François Ozon, Une nouvelle amie. Elle y retrouve Raphaël Personnaz, avec qui elle a déjà joué dans George et Fanchette (diffusé en 2010) et Quai d'Orsay (sorti en 2013).
En 2015, elle est très remarquée dans À trois on y va{{,}} de Jérôme Bonnell et Caprice{{,}} d'Emmanuel Mouret. Elle est également Marguerite dans Marguerite et Julien, le film de Valérie Donzelli en compétition au festival de Cannes 2015. En décembre de la même année, elle est membre du jury courts métrages du {{15e}} Festival international du film de Marrakech, présidé par Joachim Lafosse.