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Jean-Hugues Anglade naît à Thouars d'un père vétérinaire et d'une mère assistante sociale.
Il entre au Conservatoire national supérieur d'art dramatique de Paris, où il suit les cours d'Antoine Vitez. Cela lui permet, notamment, de faire une première apparition à la télévision en 1980 dans une adaptation par Michel Favart de La Peau de chagrin d'Honoré de Balzac.
Jean-Hugues Anglade est révélé au cinéma par Patrice Chéreau dans L'Homme blessé (1982). Puis il est dirigé par Luc Besson dans Subway, et par Jean-Jacques Beineix dans 37°2 le matin, film nommé à l'Oscar du Meilleur film étranger. Ces deux films le révèlent internationalement. Il retrouve Luc Besson pour Nikita, puis tourne avec Alain Corneau (Nocturne indien et Michel Deville (Nuit d'été en ville)).
Il s'essaie à la comédie avec Les Marmottes, tourne aux États-Unis Killing Zoe et fait une prestation remarquée dans La Reine Margot de Patrice Chéreau, rôle pour lequel il est récompensé par le César du meilleur acteur dans un second rôle en 1995.
En 1996, il passe à la réalisation, sans grand succès, avec Tonka, où il dirige sa compagne Pamela Soo. Il connaît ensuite une traversée du désert professionnelle. Il interprète quelques seconds rôles, et retrouve Jean-Jacques Beineix dans Mortel transfert, qui s'avère un échec commercial.
Il tourne de nouveau à l'étranger en 1997 sous la direction de Ringo Lam dans Risque maximum aux côtés de Jean-Claude Van Damme, puis en 2004 dans Taking lives, destins violés sous la direction de D. J. Caruso aux côtés d'Angelina Jolie, Ethan Hawke et Kiefer Sutherland.
Mostra de Venise]].
Il faut attendre 2009 pour qu'il redevienne un acteur de premier plan, à la télévision, dans les séries Sous les vents de Neptune sur France 2 et Braquo sur Canal+. Cette année marque ses retrouvailles avec Patrice Chéreau, dans Persécution.
Jean-Hugues Anglade est le père de deux garçons, nés en 2001 et 2002, issus de son union avec Mali Lecomte.
En 2001, dans l'émission Tout le monde en parle présentée par Thierry Ardisson, il révèle de façon assez inattendue avoir été violé à l'âge de 13 ans par un pédophile, à la suite d'une plaisanterie (coupée au montage) de Laurent Baffie, coprésentateur de l'émission{{,}}.
Passager du train Thalys dans lequel est déjoué un attentat le {{date}}, il critique publiquement l'attitude du personnel de restauration, qui selon lui ont abandonné les usagers pour se cacher{{,}}{{,}}{{,}}{{,}}. À l'issue de sa rencontre, le 23 août 2015, avec la directrice générale de la société Thalys, Agnès Ogier, et le président de la SNCF, Guillaume Pepy, un communiqué de presse conjoint indique que son témoignage, comme celui des autres passagers, sera pris en compte dans l’enquête interne menée par Thalys{{,}}{{,}}.