John Turturro, nait en 1957, dans le quartier de Brooklyn à New York, dans une famille catholique. Son père est originaire de Bari (Italie) et sa mère est d'origine sicilienne. Le nom Turturro vient de l'italien tortora qui signifie Tourterelle des bois. John a 6 ans lorsque sa famille quitte Brooklyn pour s'installer à Rosedale dans le quartier du Queens à New York. John sort diplômé en art dramatique de la State University of New York à New Paltz, et poursuit son cursus universitaire par un MFA (Master of Fine Arts) à l'université Yale. Il est figurant dans le film Raging Bull, en 1980.
John Turturro crée le personnage principal d'une des pièces de John Patrick Shanley, {{lang}}, lors d'une conférence de dramaturges donnée au théâtre Eugene O'Neill, en 1983 ; il le reprend l'année suivante "off Broadway", ce qui lui vaut un Obie Award.
Spike Lee admire la prestation de Turturro dans Five Corners, et lui donne un des rôles principaux de Do the Right Thing en 1989, celui de Pino, un raciste virulent. Ce film marque le début d'une longue collaboration entre Turturro et Spike Lee.
Autant à l'aise dans les rôles comiques que dramatiques, John collabore aussi avec les Frères Coen, apparaissant dans Miller's Crossing en 1990, Barton Fink en 1991, The Big Lebowski en 1998 et plus récemment O'Brother en 2000. On le retrouve aussi dans Self Control une comédie où il joue le rôle d'un patient de Jack Nicholson médecin. Il joue l'antagoniste de Johnny Depp dans Fenêtre secrète. John Turturro fait souvent des apparitions en guest star dans la série Monk où il interprète le rôle du frère excentrique d'Adrian : Ambrose Monk.
John Turturro est le producteur, réalisateur et acteur du film Illuminata (1999) dans lequel joue sa femme Katherine Borowitz.
En 2005, il écrit et dirige le film {{lang}}. Il joue aussi dans le film de Robert De Niro, Raisons d'État, où il interprète le rôle du bras droit de l'agent de la CIA Edward Wilson incarné par Matt Damon.
En 2015 il incarne l'acteur américain du film de Nanni Moretti, Mia madre.
John a deux frères : Nicholas Turturro, acteur et Ralph Turturro, enseignant. Aida Turturro, l'actrice présente dans la série Les Soprano, est sa cousine. Il a deux enfants avec sa femme Katherine Borowitz : Amedeo Turturro né en 1990 et Diego Turturro né en 2000. John est catholique et sa femme est juive.