Tucci est né à Peekskill, New York, il a grandi dans la ville voisine de Katonah, il est le fils de Jeanne (née Tropiano), une secrétaire et écrivaine, et Stanley Tucci, Senior, un professeur d'art à Horace Greeley High School à Chappaqua, New York. Ses parents sont tous deux d'origines italiennes, ils ont des racines en Calabre. Il est l'aîné de trois enfants, sa sœur est actrice Christine Tucci. Le scénariste Joseph Tropiano est un cousin. Pendant les années 1970, la famille a passé un an à Florence, en Italie. Il a étudié au John Jay High School et a obtenu son diplôme en 1982{{,}}.
L'actrice Colleen Dewhurst, qui connaissait la mère de Tucci, s'est arrangée pour que le jeune homme et l'acteur Campbell Scott, jouent dans un petit rôle en tant que soldats dans une pièce à Broadway, 30 septembre 1982.
Il commence sa carrière dans le film de John Huston, L'Honneur des Prizzi (1985) et joue le médecin dans Incidents de parcours (1988) de George Andrew Romero.
Mais c'est avec ses rôles dans L'Affaire Pélican (1993) où il interprète un tueur et Kiss of Death (1995) où il incarne un procureur malhonnête qu'il se fait remarquer.
Depuis, on l'a vu dans deux films avec Tom Hanks : Les Sentiers de la perdition (2002), où il joue Frank Nitti et Le Terminal (2004) où il incarne un chef de sécurité d'aéroport, et aussi dans Shall We Dance? (2004).
Il devient Stanley Kubrick pour les besoins du Moi, Peter Sellers (2004).
L'année 2006 est chargée pour l'acteur : au cinéma, il participe au Diable s'habille en Prada, en étant le fidèle associé de Meryl Streep, mais c'est à la télévision qu'on le remarque durant cette année avec son interprétation, en tant que guest star, du {{Dr}} Kevin Moretti dans la série télévisée Urgences qu'il incarnera durant quelques épisodes.
En 2009, il est à l'affiche de Julie & Julia, où il incarne Paul Child, le mari de Julia Child, interprétée par Meryl Streep. C'est leur deuxième collaboration depuis Le Diable s'habille en Prada.
En 2010, il incarne Mr. Harvey, le tueur de Lovely Bones. Il est d'ailleurs nommé aux Oscars dans la catégorie "Meilleur acteur dans un second rôle" pour celui-ci. La même année, il joue au côté de Cher et Christina Aguilera dans la comédie musicale Burlesque.
En novembre 2011, il s'est fiancé à la sœur d'Emily Blunt, sa co-star dans le Diable s'habille en Prada, Felicity Blunt.
En mars 2012 sort l'adaptation du roman de Suzanne Collins, Hunger Games, où il tient le rôle du présentateur des Hunger Games, Caesar Flickerman.
En 2014, il est la voix de Léonard de Vinci dans le film d'animation M. Peabody et Sherman : Les Voyages dans le temps de Rob Minkoff.