Audrey Tautou est née d'un père chirurgien-dentiste, Bernard Tautou, et d'une mère médecin, Évelyne Tautou, ancienne adjointe au maire de Montluçon, devenue conseillère municipale, et actuellement vice-présidente de l'agglomération de Montluçon chargée de la culture et PDG du centre des Congrès et de la Culture Athanor. Audrey Tautou a été prénommée ainsi en hommage à Audrey Hepburn, comme elle l'a découvert en demandant l'origine de son prénom à ses parents à la suite de l'insistance des journalistes à ce sujet (cf. En Aparté, saison 2005-2006). Elle passa son enfance et son adolescence à Montluçon avec ses deux sœurs et son frère.
On lui prête une vocation de primatologue alors qu'elle était collégienne. Elle décroche un baccalauréat scientifique avec la mention « bien ». Parallèlement à ses études supérieures (DEUG de lettres modernes à Institut catholique de Paris), elle suit une formation au Cours Florent ». Elle intègre la classe libre de l'École de théâtre un an après son arrivée.
Cependant, elle reste passionnée par les singes, ce qui motive notamment certains de ses nombreux voyages et lectures.