John Gavin Malkovich est d'origine croate par son père, ainsi qu'allemand et britannique par sa mère. Passionné de théâtre, il crée sa propre troupe à l'université où il met en scène et interprète des pièces. Après ses études, il rejoint la troupe du {{Lien}} en 1976 où, six années durant, il joue, met en scène et crée les décors de plus de cinquante productions, dont Mort d'un commis voyageur. C'est à cette époque qu'il rencontre Gary Sinise. Il s'affiche à New York, à Londres et à Los Angeles. Il remporte plusieurs récompenses, notamment le Obie Award.
Après deux apparitions à la télévision en 1981, il débute au cinéma dans True West en 1983. Pour son rôle dans Les Saisons du cœur, il est nommé à l'Oscar du meilleur acteur dans un second rôle. Il tourne avec Dustin Hoffman dans Mort d'un commis voyageur, sous la direction de Volker Schlöndorff, puis dans La Déchirure, mais c'est Steven Spielberg qui lui donne son premier grand rôle au cinéma dans l’Empire du soleil.
Le rôle qui le révèle est sans doute celui du célèbre Valmont dans Les Liaisons dangereuses, un film réalisé par Stephen Frears où John Malkovich joue aux côtés de Glenn Close, Michelle Pfeiffer et la jeune Uma Thurman.
Par la suite, Malkovich participa avec son ami Gary Sinise à l'adaptation de l'œuvre de John Steinbeck, Des souris et des hommes. En 1994, il fut nommé à un autre Oscar dans la même catégorie pour son rôle de Mitch Leary dans le film de Wolfgang Petersen, Dans la ligne de mire. En 1999, il participa au projet de Charlie Kaufman, Dans la peau de John Malkovich, réalisé par Spike Jonze, où il interprète différentes versions de lui-même. Kaufman l'invite sur son film suivant, Adaptation, également réalisé par Jonze, où Malkovich fait un caméo. The Dancer Upstairs marque les débuts de John Malkovich derrière la caméra en 2002.
Il a tourné depuis les années 2000 dans de nombreux films, couvrant un large panel des genres cinématographiques : les adaptations télévisées des Misérables (2000) et de la vie de Napoléon (2002), la comédie avec Johnny English (2003), H2G2 : le Guide du voyageur galactique (2005) et Burn After Reading (2008), les biopics avec Appelez-moi Kubrick (2005) et Klimt (2006), le fantasy avec Eragon (2006) et La Légende de Beowulf (2007) ou le drame avec L'Échange (2008) et Disgrâce (2009). Il a également été producteur de plusieurs films, dont le film de Jason Reitman, Juno, sorti en 2008.
Malkovich se tourne vers la mise en scène en 2008, et reçoit le Molière du metteur en scène pour Good Canary.
Il a été nommé parmi les 12 acteurs les plus prometteurs de 1984 par John Willis pour son rôle dans La Déchirure et 70{{e}} des 100 stars les plus sexy de l'histoire du cinéma en 1995 par le magazine britannique Empire.
John Malkovich a été marié avec Glenne Headly de 1982 à 1988 et, après avoir fréquenté Glenn Close et sa partenaire des Liaisons dangereuses, Michelle Pfeiffer, s'est remarié avec Nicoletta Peyran en 1989, rencontrée sur le plateau de Un thé au Sahara, où elle était alors seconde assistante du réalisateur Bernardo Bertolucci.
Il s'est établi avec sa famille en France, à Bonnieux dans le Vaucluse pendant 9 ans, et habite près de Boston (à Cambridge) depuis le début des années 2000. Il parle très bien le français avec un léger accent américain et se définit comme un fervent francophile.
Il se décrit comme libertarien. L'acteur William Hootkins, qui a travaillé avec Malkovich sur le téléfilm de la BBC Rocket to the Moon, a dit : « Il est si à droite que vous vous demandez s'il ne plaisante pas ». Selon certaines de ses déclarations au Chicago Tribune, il soutiendrait la peine de mort{{,}}, mais d'autres propos paraissent plus nuancés.
Il a perdu plusieurs millions avec le scandale de la chaîne de Ponzi de Bernard Madoff, lors de sa banqueroute en 2008. Mais John Malkovich reste très philosophe sur ce sujet : {{citation}}.
En février 2015, le journal Le Monde révèle que John Malkovich figure parmi la liste des clients qui fraudaient le fisc grâce à une succursale suisse de la banque britannique HSBC, auprès de laquelle il possédait un compte. L'acteur attaque alors le journal en diffamation, son avocat arguant que {{citation}}, stipulant en outre que {{citation}}.