En 1970, Kevin Kline décroche une bourse d'études et intègre la section Art Dramatique de la Juilliard School à New York.
En 1972, il monte la compagnie de théâtre City Center Acting Company avec des camarades de promotion, sous l'égide de l'acteur britannique John Houseman. La compagnie met en scène des pièces de Shakespeare, des œuvres classiques mais également une comédie musicale, The Robber Bridegroom, et donne des représentations un peu partout aux États-Unis. Il quitte la troupe en 1976 pour s'installer à New York, faisant une brève apparition sous le personnage de Woody Reed dans le feuilleton télévisé C'est déjà demain (Search For Tomorrow). Il retourne sur les planches en 1978, incarnant le rôle de Bruce Granit dans la comédie musicale On the Twentieth Century, pour lequel il obtiendra son premier Tony Award.
En 1981, il joue lors du New York Shakespeare Festival avec la chanteuse Linda Ronstadt et l'artiste Rex Smith dans une comédie musicale, The Pirates of Penzance, pour laquelle il est récompensé d'un deuxième Tony Award en tant que meilleur acteur principal. Il jouera ensuite ce même rôle dans une adaptation cinématographique qui n'aura qu'un succès très limité. Dans les années qui suivent, Kevin Kline se produit régulièrement pour le New York Shakespeare Festival, notamment dans les pièces Richard III, Beaucoup de bruit pour rien, Henry V, deux versions de Hamlet dont une qu'il produit, et obtient une nomination aux Tony Awards pour le rôle de Falstaff dans une pièce combinant les deux parties dHenri IV.
Kevin Kline s'essaie finalement au cinéma en 1982, décrochant le rôle de Nathan Landau, l'amant détraqué de Meryl Streep dans Le Choix de Sophie. Cette performance lui vaut une nomination aux Golden Globe Awards ainsi qu'aux BAFTA Awards. De 1980 au début des années 1990, Kevin Kline tourne dans plusieurs films réalisés par Lawrence Kasdan, notamment Les Copains d'Abord, Silverado, Grand Canyon, et French Kiss avec Meg Ryan. En 1989, il obtient l'Oscar du meilleur second rôle grâce à sa prestation dans Un poisson nommé Wanda. En 1999, il interprète l'ingénieux et charismatique Artemus Gordon (de la série Les Mystères de l'Ouest) dans le film Wild Wild West, aux côtés de Will Smith.
Bien que de nombreux rôles dans des films à gros budget lui aient été proposés, Kevin Kline est toujours resté distant d'Hollywood. Depuis 1989, il est marié à l'actrice Phoebe Cates, qu'il a rencontrée sept ans plus tôt sur le tournage du film Les Copains d'abord. Ils vivent à New York et ont 2 enfants : Owen (1991) et Greta (1994).
En 2006, il contribue au casting (avec Meryl Streep, Woody Harrelson, Garrison Keillor, Lily Tomlin...) de The Last Show, film de Robert Altman mettant en scène la dernière de l'émission de radio A Prairie Home Companion.