{{média externe}} Clotilde Hesme est la sœur d'Annelise Hesme et d'Élodie Hesme, qui sont également actrices. Après des études au cours Florent et au Conservatoire national supérieur d'art dramatique (auprès de Daniel Mesguich et Catherine Hiegel), elle joue à partir de 1999 dans des pièces, souvent exigeantes, au sein de la compagnie de François Orsoni dont elle sera membre durant plus de dix ans.
Elle se fait remarquer par le réalisateur Jérôme Bonnell qui la fait tourner dans Le Chignon d'Olga en 2002 puis également par Philippe Garrel qui la dirige dans des courts métrages un peu artisanaux avant de lui proposer un rôle dans Les Amants réguliers. Sa carrière démarre réellement en 2007 avec le tournage de quatre films dont Les Chansons d'amour de Christophe Honoré pour lequel elle est nommée au César du meilleur espoir féminin en 2008. Elle obtient finalement la récompense en 2012 pour Angèle et Tony (ex æquo avec Naidra Ayadi pour Polisse). Elle interprète la même année le rôle d'Adèle dans la série française Les Revenants de Fabrice Gobert.
En 2015, elle est enceinte de son deuxième enfant pendant la campagne de promotion du film Chocolat où elle a le premier rôle féminin et donne la réplique à James Thiérrée et Omar Sy.