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Neil Patrick Harris est né de parents originaires d'Irlande, tous deux avocats (mais reconvertis dans la restauration en 2004). Il a grandi à Ruidoso au Nouveau-Mexique. C'est en accompagnant son frère ainé à une audition qu'il est repéré, ce qui l'amène à jouer dans une pièce à l'école Le Magicien d'Oz. Il suit sa scolarité à l'école secondaire La Cueva d'Albuquerque (où Freddie Prinze Jr. a également étudié), où il est bon élève et joue dans des comédies musicales.
Depuis la préadolescence, il est passionné de magie, qui est devenue son passe-temps. Il est régulièrement l'hôte de soirées réservées aux magiciens, et est souvent sollicité pour faire preuve de son talent, sur les émissions de télévision ou encore dans ses rôles.
Neil Patrick Harris a commencé sa carrière d'acteur alors qu'il était encore enfant. Il joue son premier rôle significatif en 1988 dans le film Le Secret de Clara (Clara's Heart), un drame avec Whoopi Goldberg qui lui vaut une présélection aux Golden Globes, puis dans Purple People Eater en 1988.
L'année suivante, il décroche le premier rôle dans la série Docteur Doogie, pour lequel il est de nouveau nommé aux Golden Globes. Après la quatrième et dernière saison de la série, il incarne des seconds rôles dans plusieurs séries télévisées, avant d'incarner en 1995 son premier rôle principal en tant qu'adulte, dans le film de science-fiction Animal Room. Par la suite, il incarne de nombreux seconds rôles, comme dans Starship Troopers, Un couple presque parfait, Undercover Brother : Un agent très secret et Harold et Kumar chassent le burger ainsi que dans la suite de ce film, Harold et Kumar s'évadent de Guantanamo dans lequel il joue un drogué, parodie lubrique de lui-même.
De 1999 à 2000, il est la vedette, avec Tony Shalhoub, de la série Stark Raving Mad durant vingt-deux épisodes. Il incarne également des premiers rôles dans de nombreux téléfilms aux États-Unis et dans quelques séries.
Harris a également joué à Broadway dans plusieurs comédies musicales : en 2001, il tient le rôle de Tobias Ragg dans la comédie musicale Sweeney Todd. En 2002, il joue dans la pièce de théâtre La Preuve aux côtés d'Anne Heche à Broadway. En 2003, il tient le rôle d'Emcee dans Cabaret avec Deborah Gibson et Tom Bosley. En 2004, il joue le double rôle du Balladeer et de Lee Harvey Oswald dans la comédie musicale Assassins de Stephen Sondheim. Il a aussi chanté le rôle de Charles sur le disque La primevère du soir (The evening primrose), de Sondheim.
Harris retrouve le succès populaire en incarnant Barney Stinson dans la série télévisée How I Met Your Mother, rôle qu'il tient pendant les neuf saisons de la série, entre 2005 et 2014 et pour lequel il a remporté plusieurs récompenses.
Le {{date}}, lors de la {{82e}} cérémonie des Oscars, il ouvre la cérémonie avec un show chantant et dansant. La même année, il prête sa voix à Peter Parker / Spiderman dans le jeu vidéo Spider-Man : Dimensions, prestation pour laquelle il est récompensé lors des {{lang}} 2010 par le prix du meilleur doublage masculin.
En 2010, il a également participé à l'épisode 19 de la saison 1 de Glee où il chante Dream On d'Aerosmith en duo avec Matthew Morrison. En 2011, il interprète le personnage de Patrick Winslow dans Les Schtroumpfs.
Le {{date}}, il obtient son étoile sur le prestigieux Walk of Fame d'Hollywood Boulevard à Los Angeles.
En 2013, il tourne dans trois spots pour la marque Axe. En 2014, il rejoint pour deux épisodes le casting de la saison 4 de American Horror Story, où il incarne le rôle de Chester, un magicien et marionnettiste fou.
Le {{date}}, il présente la {{87e}} cérémonie des Oscars.
Le {{date}}, à la suite d'un reportage lui prêtant une relation sentimentale avec l'acteur David Burtka (l'interprète de Scooter, l'ex-petit ami de Lily dans la série How I Met Your Mother), son agent dément l'information, déclarant que Neil Patrick Harris « n'est pas de ce bord ». Ce dernier évoque cependant publiquement son homosexualité le même mois dans le magazine People. Neil et David sont en couple depuis avril 2004. Ils sont apparus officiellement en tant que couple aux Emmy Awards de {{date}}. Depuis les deux hommes apparaissent régulièrement ensemble publiquement, à des cérémonies, dans des projets communs (ils ont chanté ensemble sur scèneTake Me Or Leave Me de la comédie musicale Rent, en faveur des personnes LGBT), ou dans une célèbre émission de cuisine où Burtka est juré permanent (il s'est reconverti de la comédie à la cuisine), et où Neil fut convié en tant qu'invité d'honneur. Tous deux restent cependant très protecteurs de leur vie privée.
Le couple a adopté des « faux jumeaux » (un garçon et une fille), Gideon Scott et Harper Grace, nés le {{date}} grâce à une mère porteuse, comme indiqué sur le compte Twitter de Neil Patrick Harris.
Neil Patrick Harris et David Burtka se sont mariés le {{date}} lors d'une cérémonie intime en Italie.