D'origine italienne, Vincent D'Onofrio a enchaîné les rôles mineurs, jusqu'à Full Metal Jacket de Stanley Kubrick où il interprète le rôle de la recrue Lawrence, dit « Gomer Pyle » (« Engagé Baleine » dans la version française), rôle pour lequel il a dû prendre {{unité}}. Il s'y fait remarquer par son interprétation sombre et inquiétante.
Il a alors accès à de plus grand rôles comme dans JFK d'Oliver Stone et Malcolm X de Spike Lee où il interprète le même rôle, à savoir celui de Bill Newman, témoin du meurtre de Kennedy et lors du procès de Clay Shaw. Son rôle dans Men in Black relève du grand numéro d'acteur de composition.
Il intègre la distribution de la série New York, section criminelle (Law and Order Criminal Intent) en 2001, dans le rôle de l'inspecteur Robert Goren (la voix française est assurée par Thierry Buisson). Depuis quelques années, de nombreux désaccords apparaissent entre lui et la production, notamment à cause de malaises (simulés selon la production) répétés. On voit notamment pendant la saison 5 qu'il n'interprète plus que la moitié des épisodes, du fait de sa fatigue.
Depuis 2015, il interprète le rôle de Wilson Fisk, l'antagoniste principal, dans l'adaptation télévisée du comic Daredevil produite par Netflix.