Rose est née à Balmain, un quartier de Sydney avec des origines écossaises et irlandaises{{,}}. Sa mère se nomme Jane et son père se nomme Robin Byrne. Son père est statisticien semi-retraité, tandis que sa mère est directrice d’une école primaire en Australie. Elle est la plus jeune de quatre enfants ; George est musicien, Lucy est attachée de presse, et Alice est artiste à Londres.
Alors qu’elle n’est que toute petite, Rose Byrne montre un réel intérêt pour le théâtre et la comédie, mais ses parents préfèrent qu'elle privilégie ses études. C’est alors qu’à l’âge de huit ans, grâce à l’aide de sa grande sœur qui réussit à convaincre leurs parents de l’inscrire dans une célèbre école de théâtre en Australie, que Byrne monte pour la toute première fois sur les planches, après quoi, elle sera remarquée par un producteur qui lui offre son premier rôle au cinéma dans Dallas Dolls aux côtés de Sandra Bernhard, à l'âge de 13 ans. Le film sera un flop, mais la jeune fille vient de se rendre compte qu’elle est faite pour ce métier.
Ses parents ont toujours été très sévères en ce qui concerne les études, sa mère étant directrice d’école primaire. Malgré cela, ils préfèrent la placer dans une école populaire qui offre aussi des cours de théâtre. À 18 ans, elle entre à l’université et commence des études en art tout en continuant à monter sur les planches. Non satisfaite de n’être diplômée qu'en art, elle obtiendra également un diplôme pour des études en littérature anglaise.
Rose Byrne commence sa carrière théâtrale au Sydney Theater Company, en jouant Olga dans Les Trois Sœurs, une pièce écrite par Anton Tchekhov. Elle obtient la même année le rôle principal dans la pièce La dispute signée Marivaux.
Pour ses 19 ans, elle est diplômée de l’Institut national d’art dramatique à Sydney (NIDA), une école réputée pour avoir formé entre autres, Cate Blanchett, Mel Gibson, Nicole Kidman, et encore Toni Collette ; elle est d’ailleurs devenue ambassadrice du NIDA en 2006.